糖尿病肾病（DN）是一种严重的糖尿病并发症，涉及20%-40%的糖尿病患者。长期的糖尿病肾病易进展为终末期肾病，病理表现为严重的肾脏纤维化，并最终导致死亡。目前临床中尚无治疗糖尿病肾病的特效药。因此，领域内亟待对其发病机制更详细全面的了解和阐释，以开发更好的药物靶点。2023年来自中山大学的黄河清教授，广州中医药大学的刘中秋教授，以及广州中医药大学的王少贵研究员等团队联合于Cell Reports上发表了题为“The degradation of TGR5 mediated by Smurf1 contributes to diabetic nephropathy”的研究成果，发现E3泛素连接酶Smurf1与代谢调节因子TGR5相互作用，并在肾小球系膜细胞（GMCs）中介导TGR5的泛素化和蛋白酶体降解。Smurf1缺失可恢复TGR5水平并减轻糖尿病小鼠的肾损伤。为治疗糖尿病肾病提供了新的靶点与策略。

 

 

TGR5是一种膜型G蛋白偶联受体，在调节葡萄糖和脂质代谢中起着至关重要的作用，被认为与代谢紊乱的疾病相关。已有研究发现TGR5在糖尿病小鼠模型的肾脏中表达水平降低。为了研究TGR5表达下调的机制，作者首先在STZ/ HFD诱导的糖尿病小鼠的肾小球中验证了TGR5的表达下调；并在从SD大鼠分离的原代GMCs中给予高浓度葡萄糖培养基（HG）刺激，发现TGR5蛋白水平呈时间依赖性的降低，而Tgr5 mRNA水平没有变化，这表明HG影响的是TGR5蛋白稳定性。IF图像显示，在HG刺激下，GMCs的细胞质中TGR5呈颗粒状染色，表明原本位于膜上的TGR5受体内化。蛋白酶体抑制剂逆转了HG诱导的蛋白表达下调，同时TGR5在HG刺激下泛素化增加。以上数据表明，HG刺激的GMCs中TGR5蛋白水平的下调是由泛素化和蛋白酶体降解诱导的。（图1）

 

图1 TGR5下调由蛋白酶体降解诱导

 

接下来，作者对TGR5进行了免疫沉淀的质谱分析，以鉴定和TGR5相互作用的E3泛素连接酶，并鉴定出三个阳性候选物（Trim21，Nedd4和Smurf1）。已知Smurf1与炎症和肾纤维化密切相关，且对Smurf1过表达后显著下调了TGR5，因此作者猜测Smurf1可能是HG刺激下TGR5的调节因子。IF图像显示Smurf1和TGR5在膜上共定位。TGR5和Smurf1的不同domain缺失突变体co-IP结果表明，TGR5的ICL2区域和Smurf1的HECT结构域介导其相互作用。这表明，Smurf1在HG刺激下与TGR5相互作用，并且这种相互作用是由TGR5的ICL2区域和Smurf1的HECT结构域介导的。

为了确定Smurf1在肾脏中的作用，作者首先在db/db小鼠和HG诱导的GMCs中观察到Smurf1明显上调。为了进一步研究过表达的Smurf1的影响，作者通过对C57BL/6J小鼠尾静脉注射AAV-Smurf1以过表达Smurf1，与对照小鼠相比，实验组小鼠24小时尿蛋白（24 h UP）和β-N-乙酰葡糖胺苷酶（NAG）活性以及血清肌酐（Cr）和血尿素氮（BUN）显著增加，表明肾功能严重下降。此外，氧化应激指标增加，炎症和纤维化标志物表达也显著上调，肾小球形态严重受损，GBM增厚，胶原纤维过度沉积。提示过表达Smurf1后会造成小鼠的严重肾功能下降、肾纤维化、氧化应激和炎症。

进一步，作者观察了Smurf1缺失对糖尿病小鼠肾脏的影响。Smurf1-KO小鼠（Smurf1^−/−）和野生型小鼠（WT）用HFD/ STZ诱导DM后，Smurf1^−/−的空腹血糖（FBG）和糖化血清蛋白（GSP）的水平与WT小鼠并无差别，肾小球病变和纤维化程度减轻，24 h UP，Cr和BUN水平下降，氧化应激和炎症程度明显降低。为确定这与Smurf1缺乏直接相关，对Smurf1^−/−尾静脉注射AAV-Smurf1，以上保护作用消失。这些数据表明，Smurf1缺失可保护小鼠免受STZ/ HFD诱导的肾功能下降和纤维化损伤。（图2）

 

图2 Smurf1对肾脏损伤的影响

 

为了探究 Smurf1 是否通过调节TGR5 降解诱导肾损伤，作者在GMC 中观察到 Smurf1 过表达伴随TGR5 蛋白表达下调，并存在剂量依赖性。 Smurf1敲低可上调HG刺激下降低的TGR5。AAV-Smurf1小鼠肾脏中TGR5水平降低，而Smurf1^−/−逆转了DM诱导的TGR5降低。蛋白质半衰期测定显示，GMC中Smurf1的过表达加速了TGR5的降解，Smurf1的敲低减缓了其降解速率。蛋白酶体抑制剂MG132逆转了过表达Smurf1诱导的TGR5下调。

在Smurf1的HECT结构域中，Cys699残基是催化活性位点，在与泛素分子形成硫酯键时起着至关重要的作用。为了确定Smurf1诱导TGR5降解是否取决于其泛素化活性，作者在GMC中过表达Smurf1和Smurf1 C699A突变体。突变体的过表达逆转了TGR5表达下调，并去除了Smurf1诱导的TGR5泛素化。这些以上数据证实了Smurf1介导了TGR5蛋白的泛素化降解。（图3）

 

图3 Smurf1介导TGR5泛素化降解

 

进一步，作者确定了TGR5泛素化的具体位点。通过突变体转染确定Smurf1通过促进TGR5的K11/48连接的多泛素化来诱导降解。

为了直接证明TGR5对糖尿病肾病的保护作用，作者对db / db小鼠注射AAV-TGR5 5周后观察。与对照组相比，db / db + AAV-TGR5小鼠肾功能指标改善，氧化应激减轻，系膜扩张、GBM增厚、胶原纤维过度沉积等现象明显改善。TGR5蛋白过表达可以减轻db / db小鼠肾损伤。（图4）

 

图4 TGR5过表达减轻db / db小鼠肾损伤